На пути к персонализированной медицине: анализ сочетанной эффективности антимитотических препаратов и ингибиторов семейства bcl-2 белков в комплексной химиотерапии

Наименование проекта: На пути к персонализированной медицине: анализ сочетанной эффективности антимитотических препаратов и ингибиторов семейства bcl-2 белков в комплексной химиотерапии.

ИРН AP08857554

Руководитель проекта – профессор Воробьев И.А.

ORCID No: 0000-0002-1815-7829

Scopus ID:  “Vorobjev, Ivan A."  6506052936

Web of Science ResearcherID:    B-2776-2015

 

Введение

Проект посвящен исследованию совместного действия ингибиторов деления клеток и анти-апоптотических белков для определения оптимальной последовательности и длительности их применения для эффективной элиминации раковых клеток. Он является продолжением исследований, выполненных в рамках предыдущего проекта МОН (проект AP05134232). Ранее мы показали, что значительная часть клеток, задержанных в митозе, не погибает, а переходит в интерфазу без расхождения хромосом, причем некоторые клетки выживают даже в присутствии высоких (миллимолярных) концентраций ингибиторов митоза. В результате ингибиторы митоза оказывают, как правило, цитостатический, но не цитотоксический эффект. Таким образом, возникает вопрос, можно ли с помощью дополнительного воздействия увеличить частоту гибели клеток, арестованных в митозе и ускользающих из него?

На основании собственных и литературных данных мы полагаем, что задержанные в митозе клетки и многоядерные клетки, возникающие в результате ускользания из митоза, находятся в состоянии стресса и будут более чувствительны к индукции апоптоза, чем клетки, находящиеся в интерфазе, или проходящие нормальное деление. Таким образом, наша центральная гипотеза состоит в том, что клетки, прошедшие через митотический арест, более чувствительны к индукторам апоптоза по сравнению с интерфазными клетками и могут быть избирательно элиминированы при использовании ингибиторов анти-апототических белков. Для проверки данной гипотезы предполагается исследовать эффект сочетанного воздействия двух групп ингибиторов - митостатиков для накопления делящихся клеток и ингибиторов анти-апоптотических белков из группы bcl-2 (Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1) для селективного удаления раковых клеток.

Результаты, полученные в ходе выполнения проекта:

Определены минимальные и наиболее эффективные митостатические концентрации нокодазола, винорельбина, таксола и эпотилона Б для одиннадцати клеточных культур (нормальные клетки 3T3, первичные человеческие фибробласты, иммортализированные кератиноциты HaCaT и раковые клетки MCF-7, HeLa, А549, HT1080, РС-3, Du-145, U2-OS, U-118). Показано, что при достижении эффективных концентраций ингибиторов все клетки оказываются заблокированными в митозе на длительное время (митотический арест) – от 4-5 до 30-40 часов. В результате данного воздействия возможны только два исхода: гибель в митозе и ускользание из митоза в интерфазу без расхождения хромосом. Мы показали, что гибель клеток во время митотического ареста идет по пути индукции апоптоза. Клетки HaCaT и  HeLa, в подавляющем большинстве случаев, погибают в результате митотического ареста. Другие культуры демонстрируют большую устойчивость, и переходят из митотического ареста в интерфазу без расхождения хромосом (митотическое проскальзывание – mitotic slippage). В результате митотического проскальзывания образуются многоядерные полиплоидные клетки. Часть таких клеток погибает вскоре после выхода из митоза в интерфазу. Другие многоядерные клетки в некоторых линиях (А549, РС-3, НТ1080) сохраняют жизнеспособность в течение длительного времени и могут образовывать клоны.

Мы показали, что количество ядер в клетках, проскользнувших из митотического ареста, зависит от использованного ингибитора динамики микротрубочек. Оно максимально в случае таксола (в среднем образуется около 5-8 ядер в каждой клетке) и минимально в случае нокодазола (как правило, образуется два или три ядра, иногда – одно большое ядро).

Возникающие под действием таксола множественные ядра часто были связаны друг с другом тонкими перетяжками (Рисунок 1).

Рисунок 6 – Изменение морфологии ядер клеток А-549 в результате митотического проскальзывания. Окраска Хехст 33258. Конфокальная микроскопия. Линейка – 5 мкм. Слева – две контрольных клетки, посередине – две одноядерных клетки 9внизу) и одна многоядерная клетка (наверху) после инкубации с нокодазолом (100 нМ, 24 часа). Справа – многоядерная клетка после инкубации с таксолом (300 нМ).

Многоядерные клетки после проскальзывания при отмывке ингибитора вступают в пролиферацию,  и могут продуцировать как многоядерные, так и одноядерные клетки (Рисунок 2), не теряющие способность делиться в ряду поколений. Время начала делений и клоногенная способность этих клеток также зависит от использованного препарата – она минимальна в случае таксола.

Рисунок 2 – Клетки А549 после отмывки от нокодазола и таксола демонстрирующие пролиферативную активность.

На клетках нескольких линий были проведены эксперименты по сочетанному воздействию трёх ингибиторов микротрубочек (нокодазол, винорельбин, таксол) и пяти ингибиторов анти-апоптотических белков: два ингибитора bcl-xL; один ингибитор bcl-2 и два ингибитора Mcl-1. Все эти ингибиторы не демонстрируют токсического эффекта на клетки в условиях нормального культивирования в концентрациях до 10-30 мкМ. Показано, что при одновременном воздействии ингибиторов митоза и анти-апоптотических белков, специфическим эффектом индуцировать гибель клеток во время митотического ареста и предотвращать их выход в интерфазу обладают только ингибиторы bcl-xL. Эти ингибиторы (Навитоклакс, А-1155463) эффективны в отношении арестованных в процессе деления клеток в низких (наномолярных) концентрациях и демонстрируют дозо-зависимый эффект, ускоряя гибель задержанных в митозе клеток в микромолярных концентрациях (Рисунок 3). Ингибиторы двух других анти-апоптотических белков (bcl-2 и Mcl-1) эффекта на клетки, заблокированные в митозе, не оказывают.

 

Рисунок 3. Судьба клеток А549 (в % отношении), после митотического проскальзывания под действием минимальных эффективных доз Нокодазола, Таксола и Винорельбина и сочетанным воздействием данных ингибиторов с навитоклаксом.

 

Методы исследования: в работе применяются ингибиторы динамики микротрубочек, винорельбин, таксол, эпотилон Б. Для изучения их влияния на различные процессы (деление клеток, их подвижность, индукция апоптоза и проч.) используется световая цейтраферная и флуоресцентная высокопроизводительная микроскопия, конфокальная микроскопия, а также проточная цитометрия.

В рамках выполнения проекта опубликованы две статьи в международных рецензируемых журналах (Q1):

  1. Kauanova S., Urazbayev A., Vorobjev I. 2021. The frequent sampling of wound scratch assay reveals the “opportunity” window for quantitative evaluation of cell motility-impeding drugs. Frontiers in cell and developmental biology 9: 640972. Published online 2021 March 11. doi: 10.3389/fcell.2021.640972
  2. Urazbayev A., Serikbayeva A., Tvorogova A., Duisenbayev A., Kauanova S., Vorobjev I. 2021. On the relationship between EB3 profiles and microtubules growth in cultured cells. Frontiers in Molecular Bioscience. 8: 745089. Published online: 08 November, 2021. doi: 10.3389/fmolb.2021.745089.

Представлен постер на ежегодную конференцию ASCB/EMBO Annual meeting (USA):

Temirgaliyev A., Kauanova S., Ten M., Vorobjev I.A. 2021. Improved initial cell spreading on the substrate depends on the cell size. Molecular Biology of the Cell Vol. 32, No. 22. ASCB Annual Meeting abstracts, ID#P777. The American Society for Cell Biology. Published Online: 29 Nov 2021. https://doi.org/10.1091/mbc.E21-11-0545